做分子遗传实验时，常常需要设计引物。虽然设计引物看似简单，但对新手来说却无从入手。通常引物由正向和反向一对组成。下面介绍如何逐步设计这对引物。首先，你需要一款引物设计软件，我常用的是DNAMAN，它功能实用且易于操作，网上即可下载。有了工具后，设计便事半功倍。
1、 首先获取需要设计引物的目标基因，以下以一段GFP基因为例进行说明。可将目标基因序列保存为txt文件，或直接复制后，在DNAMAN中新建文档并粘贴进去。以下是用于引物设计的GFP基因序列。
2、 打开DNAMAN软件，依次选择菜单中的Primer→Load Primer→From Input。接着，从上一步得到的目的基因序列中，复制开头附近的20个左右碱基粘贴到输入框内（引物长度应为15-30bp，通常选择18-27bp较为合适）。例如，先测试前20个碱基是否适合作为引物，将ATTGATGTGATATCTCCACT粘贴进去，然后点击OK确认。这样即可完成引物的初步设置与验证。
3、 再次点击引物，选择熔解温度选项，打开设置对话框。在这里你能看到碱基序列、碱基数以及热力学参数，即Tm值（熔解温度）。通常，Tm值在55℃到70℃之间较为理想。PCR仪的退火温度一般比引物的Tm值低5℃左右。不过，在实际操作中，我们常将退火温度设为55℃，因此Tm值在60℃左右会更合适。
4、 上图显示，20个碱基的Tm值仅为49度，偏低，需增加碱基数。将前24个碱基粘贴进去，点击Show Tm查看引物Tm值，结果为60.3度，非常合适。至此，正向引物设计完成，保存这24个碱基序列以备用。
5、 设计反向引物时，先对目标基因序列进行反向互补处理，再参照正向引物的设计方法完成。反向互补操作可利用DNAMAN软件快速实现。
6、 启动DNAMAN后，选择左侧第一个Channel，接着点击菜单栏中的Sequence→Load Sequence→From Sequence File…，将保存有目标基因的txt文件导入软件。注意，打开txt文件时，要在打开窗口的文件类型中选择All Files，确保正确加载文件。这样可以顺利将目的基因序列导入DNAMAN进行后续操作。
7、 序列已导入首个通道，双击该通道即可查看序列的详细信息。
8、 保持Channel 1选中，依次点击Sequence和Display Sequence，打开相应对话框。
9、 在对话框中选择Reverse Complement Seq，取消其他选项，最后点击OK。
10、 这样就能获取目的基因的反向互补序列。
11、 针对这条反向互补序列，按照设计正向引物的方法进行操作即可。这里直接给出设计结果：选取前24个碱基，序列为TCAAAGATCTACCATGTACAGCTC，其Tm值为57.6，非常合适。至此，引物设计全部完成。接下来，可将前面设计的正向引物与这里的反向引物一并交给公司合成。
12、 拿到引物后，用PCR仪扩增目标基因的方法，相信实验室里总有人会操作，简单学一下就懂。若不清楚，可在下方提问，我会根据需求，再分享一篇关于使用PCR仪的经验。
