近期收到不少提问，其中包括基因序列分析的方法。下面整理了BLAST工具的使用步骤，希望对大家有所帮助。这是生物信息学中的重要方法之一。
1、 首先，利用NCBI进行序列的同源比对与相似性分析，再通过DNAMAN 5.0和DNAsist 20软件分析cDNA序列，获取氨基酸序列。
2、 随后，推测分子量，利用DNAMAN 5.0软件进行氨基酸序列对比，借助SeaView软件，通过邻位相连法构建系统发育树。
3、 以pMD18-IRF3a为模板，按照质粒提取试剂盒的操作说明提取质粒。使用微量核酸测定仪检测质粒的浓度与纯度。根据公式：质粒拷贝数=（6.02×10^14×质粒浓度）/[16，计算质粒的拷贝数。采用绝对荧光定量PCR检测IRF3基因表达水平。
4、 将标准质粒用双蒸水稀释，制成1010至10? copies/μL的9个浓度梯度。从中选取107、106、105、104、103和10这6个梯度作为模板，以IRF3F3和IRF3R3（见表1）为特异性引物，进行荧光定量PCR反应，每组反应设置3个重复样本。
5、 随后，在Chromo4Real-Time Detection System (MJ Research)上进行反应，具体操作按照Green Two-Step qRT-PCR SuperMix荧光定量PCR试剂盒说明书执行，反应体系设定为20 μL。
6、 反应程序如下：95°C预变性30秒，随后45个循环包括95°C变性5秒、57°C退火15秒和72°C延伸15秒。之后从55°C开始，以每30秒升高0.5°C的速度，历经81个循环升至95°C。反应完成后，分析扩增曲线与熔解曲线，并构建标准曲线。
